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AMPK激酶活性比色法定量檢測試劑盒

點擊下載該文件    日期:2021/6/21 11:43:28

 組織AMPK 激酶活性比色法定量檢測試劑是一種旨在通過多肽底物受到AMPK 磷酸化后,進而由丙酮酸激酶和乳酸脫氫酶連續(xù)循環(huán)法反應系統(tǒng),測定產(chǎn)生 ADP 過程中,伴隨的還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH的氧化反應,即采用比色法測定其氧化后吸光峰值的變化,以分析組織裂解樣品中 AMPK 活性的權威而經(jīng)典的技術方法。該技術由大師級科學家精心研制、成功實驗證明的。其適用于各種組織裂解萃取液樣品(動物、人體、部分或完全純化酶樣品中 AMPK 激酶的定量檢測,以及抑制劑和激活劑的篩選。產(chǎn)品嚴格無菌,即到即用,操作簡捷,性能穩(wěn)定,高度敏感。

技術背景

5’AMP活化蛋白激酶(5’AMP activated protein kinase;AMPK)屬于絲氨酸/蘇氨酸激酶(serine/threonine protein kinase)家屬成員之一。其為從酵母到人體高度進化保留的激酶復合物,由3個亞體,α、β、γ構成:其中γ亞體有4個胱硫醚β合酶cystathione beta synthaseCBS結構域,又稱為巴特曼Bateman構域,以探測AMPATP的比例;α亞體含有催化結構域,一旦收到AMPKKLKB1/MO25/STRAD 復合物催化的磷酸化后,AMPK被激活。所有亞體都有不同異構體形式,包括α1、α2、β1、β2γ1、γ2 和γ3。其功能在于保持細胞能量內(nèi)環(huán)境恒定:促進脂肪酸β氧化、抑制膽固醇合成、促進肌肉葡萄糖吸收和調節(jié)胰島素分泌等。AMPK在肝臟、腦和肌肉組織中高度表達。其磷酸化目標序列為 LKKLTRASFFGQ�;诘孜�LKKLTRASFFGQ,在ATP的存在下,受到5’AMP活化蛋白激酶的磷酸化,獲得產(chǎn)物磷酸化多肽, 進而通過丙酮酸激酶pyruvate kinase;PK和乳酸脫氫酶lactate dehydrogenase;LDH反應系統(tǒng)中,還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(reduced nicotinamide adenine dinucleotide;NADH)轉化為氧化型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotideNAD,其峰值的變化(340nm),來定量分析5’AMP活化蛋白激酶的活性。其反應方式為:

產(chǎn)品內(nèi)容

 清理液(Reagent A毫升

 裂解液(Reagent B毫升

 緩沖液(Reagent C毫升

 酶促液(Reagent D微升

 反應液(Reagent E微升

 底物液(Reagent F微升

 陰性液(Reagent G微升

產(chǎn)品說明書1 

保存方式

保存  清理液(Reagent A 4℃冰箱里;其余的保存在-20℃冰箱里,嚴格避免光照和反復凍融;有效保證 6 

用戶自備

AMPK 激酶:用于抑制劑篩選

1.5 毫升離心管:用于樣品保存的容器

15 毫升錐形離心管:用于樣品處理的容器

(微型)臺式離心機:用于細胞預處理

比色皿或酶標板:用于比色分析操作的容器分光光度儀或酶標儀:用于樣品比色分析

實驗步驟

一、 待測樣品準備

1. 手術取出動物組織,并秤重 500 毫克組織重量

2. (選擇步驟)放進預冷的 15 毫升錐形離心管

3. (選擇步驟)加入毫升  清理液(Reagent A清洗

4. (選擇步驟)抽去清理液

5. 移入到一個液氮凍存管

6. 即刻放進液氮罐過夜

7. 次日從液氮罐里取出,即刻(最快速度)用研磨棒碾碎組織成粉末狀(注意:切莫使組織凍融

8. 放進一個 15 毫升錐形離心管

9. 加入置于冰槽里的微升  裂解液(Reagent B 10.強力渦旋震蕩 30 秒,充分混勻

11. 放進冰槽里孵育 30 分鐘,期間每 10 分鐘強力渦旋震蕩 30 注意:如需暫時停止,放進-70℃冰箱里儲存?zhèn)溆?/span>

12. 即刻放進 4℃臺式離心機離心 10 分鐘,速度為 10000g

13. 小心移取上清液到新的無菌的 1.5 毫升離心管

14. 移取 10 微升進行蛋白定量檢測(注意:建議使用  Bradford 蛋白質濃度定量試劑盒-

GMS30030.1

15. 放進-70℃的冰箱里保存或置于冰槽里備用
二、 測定準備

1. 準備好待測樣品(例如細胞裂解懸液等,置于冰槽里

2. 設定好分光光度儀(溫度為 30:波長為 340nm,間隔 1 分鐘,讀數(shù) 6 次( 5 分鐘,并置零三、 背景對照測定

1. 移取微升  緩沖液(Reagent C到新的比色皿

2. 加入微升  酶促液(Reagent D

3. 加入微升  陰性液(Reagent G

4. 放進 30℃培養(yǎng)箱里靜置 2 分鐘

5. (選擇步驟)放進分光光度儀,置零

6. (選擇步驟)取出比色皿


7. 加入微升  反應液(Reagent E

8. 加入微升  底物液(Reagent F

9. 上下傾倒數(shù)次,混勻(限定在秒之內(nèi)) 10.即刻放進分光光度儀檢測,此為背景空對照:340 波長讀數(shù) 0 分鐘 340 波長讀數(shù) 5 分鐘

四、 樣品測定

1. 移取微升  緩沖液(Reagent C到新的比色皿

2. 加入微升  酶促液(Reagent D

3. 加入 5 微升待測樣品(注意:50 微克細胞裂解懸液蛋白;樣品須溶解

4. 放進 30℃培養(yǎng)箱里靜置 2 分鐘

5. (選擇步驟)放進分光光度儀,置零

6. (選擇步驟)取出比色皿

7. 加入微升  反應液(Reagent E

8. 加入  底物液(Reagent F

9. 上下傾倒數(shù)次,混勻(限定在3 秒之內(nèi))
10.即刻放進分光光度儀檢測,此為樣品讀數(shù):
340 波長讀數(shù) 0 分鐘 340 波長讀數(shù) 5 分鐘

五、 計算樣品活性

單位=微摩爾 NADH/分鐘
六、酶標板測定

1.  96 孔酶標板上做好相應標記:背景對照和樣品

2. 分別移取微升  緩沖液(Reagent C 96 孔板中

3. 分別加入微升  酶促液(Reagent D

4. 分別加入 5 微升  陰性液(Reagent G或待測樣品(50 微克細胞裂解懸液蛋白)到相應孔中(注意:樣品須清澈

5. 輕輕搖動 96 孔酶標板

6.  30℃溫度下孵育 2 分鐘

7. 分別加入微升  反應液(Reagent E

8. 分別加入微升  底物液(Reagent F

9. 輕輕搖動酶標板

10. 即刻放進酶標儀檢測:0 分鐘讀數(shù)和 5 分鐘讀數(shù)

11. 活性計算:

 單位=微摩爾 NADH/分鐘
七、抑制劑篩選

1.  96 孔酶標板上做好相應標記:背景、完全活性和待測抑制劑樣品

2. 按下表加入試劑

內(nèi)容物

樣本背景

完全酶活性

待測抑制劑酶活性

 緩沖液

Reagent C

微升

微升

微升

 陰性液

Reagent G

微升

——

——

待測抑制劑

微升

――

微升

用戶自備的純化酶

——

微升(1 毫單位)

微升(1 毫單位)

96 孔板每孔總量

樣本背景孔

(  微升)

完全活性孔

(  微升)

待測抑制劑樣品孔

( 微升)

3. 輕輕搖動酶標板,混勻

4. 放進 30℃培養(yǎng)箱里靜置 30 分鐘

5. 分別加入微升  酶促液(Reagent D

6. 分別加入微升  反應液(Reagent E

7. 分別加入微升  底物液(Reagent F

8. 輕輕搖動酶標板

9. 即刻放進酶標儀檢測:獲得初始吸光讀數(shù)OD 10.放進    30℃培養(yǎng)箱里孵育    30        分鐘11.即刻放進酶標儀檢測:獲得終點吸光讀數(shù)OD

12.實際吸光讀數(shù):初始吸光讀數(shù)(OD—終點吸光讀數(shù)(OD

13.抑制活性計算:

1)

2)IC5050%抑制率所需的抑制劑濃度

3 直接構建抑制曲線:縱座標(Y 軸)為吸光讀數(shù) OD;橫座標(X 軸)為已知抑制劑濃度 

注意事項

1. 本產(chǎn)品為 25 次操作,包括背景操作

2. 操作時,須戴手套

3. 系統(tǒng)操作過程中,背景測定只需 1 

4. 樣品處理忌用磷酸緩沖溶液

5. 樣品須澄清,至關重要

6. 加入  底物液(Reagent F 3 秒內(nèi)即刻比色測定

7. 測定值由高到低變化;測定可持續(xù) 30 分鐘

8. 比色測定后,比色皿須清洗徹底

9. 樣本測定 0 分鐘讀數(shù)高于 5 分鐘讀數(shù)表明具有酶活性

10. 建議待測樣本蛋白濃度為 50 微克/5 微升(本公司提供  Bradford 蛋白質濃度定量試劑盒-

GMS30030.1

11. 如果待測樣品濃度過高或過低,可以調整樣品濃度


12. 可以使用 AMPK 抑制劑(DORSOMORPHIN)作為抑制劑對照或陰性對照

135’AMP 活化蛋白激酶活性單位濃度定義:在 30℃溫度下,pH 7.5 條件下,每分鐘內(nèi)能夠氧化 1 微摩爾還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)所需的酶量作為一個活性單位

14.本公司提供系列蛋白激酶檢測試劑產(chǎn)品

質量標準

1. 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定

2. 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定檢測敏感

使用承諾

秉著信譽至上、客戶滿意、質量承諾的宗旨為我們的用戶提供優(yōu)質產(chǎn)品和服務。用戶收到貨后, 應按照產(chǎn)品說明書上的規(guī)定妥善保管并在有效期內(nèi)使用。我們的產(chǎn)品在銷售前已作嚴格的質量鑒定,保證說明書所述的使用效果。在貨到后 10 天內(nèi)若發(fā)現(xiàn)確屬本產(chǎn)品的質量問題,請立即以書面形式(實驗報告) 與本公司聯(lián)系,并將該產(chǎn)品退回,經(jīng)檢驗確系產(chǎn)品質量所致,本公司負責更換產(chǎn)品。如系使用者錯誤操作所致,本公司不承擔由此造成的損失。

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