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NP-40 裂解液

點(diǎn)擊次數(shù):1972 日期:2018/6/25 14:23:23

NP-40 裂解液
產(chǎn)品簡(jiǎn)介:
    多種成分均可以從細(xì)胞中提取總蛋白,如 Triton、SDS、NP-40 等。NP-40 裂解液(NP-40 Lysis Buffer)是采用一種溫和的裂解方法獲得總蛋白的裂解液。所獲得的蛋白質(zhì)可以用于 PAGE 電泳、Western、免疫沉淀(Immunol Precipitation,IP)和免疫共沉淀(co-IP)等,并含有多種蛋白酶抑制劑成分,可有效抑制蛋白的降解,并維持原有的蛋白間相互作用。
    Jisskang NP-40 Lysis Buffer 主要由Tris-HCl、NaCl、NP-40 以及sodium pyropho-sphate,β-glycerophosphate,sodium fluoride, EDTA等多種蛋白酶抑制劑組成。用NP-40 Lysis Buffer得到的蛋白,可以用BCA蛋白定量試劑盒和Bradford蛋白定量試劑盒測(cè)定蛋白濃度。
產(chǎn)品組成:
   產(chǎn)品組成
   規(guī)格
Storage
NP-40 Lysis Buffer
   100ml
-20℃
PMSF(100mM)
1.5ml
-20℃
使用說(shuō)明書
            1份
操作步驟(僅供參考):
(一)貼壁培養(yǎng)細(xì)胞
1、取NP-40 Lysis Buffer置于室溫溶解混勻,加入PMSF,使PMSF終濃度為 1mM。
2、去除貼壁細(xì)胞的培養(yǎng)液,用 PBS、NS 或無(wú)血清培養(yǎng)液清洗1次,低速離心,棄上清,留取沉淀。
3、按照6孔板每孔加入150~250μl含有PMSF的裂解液的比例,加入NP-40 LysisBuffer 。移液器輕輕吹打,使裂解液和細(xì)胞充分接觸。置于冰上或4℃裂解15~30min,通常裂解液作用于細(xì)胞1~3s內(nèi),細(xì)胞就會(huì)被裂解。
4、10000~12000g,4℃離心5~10min(如無(wú)低溫離心機(jī),室溫下離心亦可),取上清。
5、進(jìn)行后續(xù)的SDS-PAGE、Western、免疫沉淀和免疫共沉淀等操作。
(二)懸浮培養(yǎng)細(xì)胞
1、取 NP-40 Lysis Buffer 置于室溫溶解混勻,加入 PMSF,使 PMSF 終濃度為 1mM。低速離心懸浮細(xì)胞,棄上清,收集沉淀。
2、用手指輕彈細(xì)胞,使其松散。按照6孔板每孔細(xì)胞加入150~200μl含有PMSF的裂解液的比例,加入NP-40 Lysis Buffer 。通常6孔板每孔細(xì)胞加入150μl裂解液已經(jīng)足夠,但如果細(xì)胞密度非常高可以適當(dāng)加大裂解液的用量到200~250μl。再用手指輕彈以充分裂解細(xì)胞,充分裂解后應(yīng)沒(méi)有明顯的細(xì)胞沉淀。
3、10000~12000g,4℃離心5~10min(如無(wú)低溫離心機(jī),室溫下離心亦可),取上清。
4、進(jìn)行后續(xù)的SDS-PAGE、Western、免疫沉淀和免疫共沉淀等操作。
(三)組織樣本
1、取 NP-40 Lysis Buffer 置于室溫溶解混勻,加入 PMSF,使 PMSF 終濃度為 1mM。把組織剪切成細(xì)小的碎片,越小越好。
2、取在液氮或超低溫冰箱中冷凍 30min 以上的組織,迅速用液氮研磨,研磨過(guò)程盡量控制在1~2min之內(nèi),以減少蛋白的降解。
3、按照每20mg組織加入150~250μl裂解液的比例加入含有PMSF的裂解液。冰上或4℃裂解30~60min。
4、步驟3、4亦可以采用如下過(guò)程:按照每 20mg組織加入150~250μl裂解液的比例,加入含有PMSF的NP-40 Lysis Buffer。用玻璃勻漿器或組織研磨器勻漿,直至充分裂解,該過(guò)程盡量控制在1~2min之內(nèi),以減少蛋白的降解。
5、10000~12000g,4℃離心5~15min(如無(wú)低溫離心機(jī),室溫下離心亦可),取上清。
6、進(jìn)行后續(xù)的 PAGE、Western、免疫沉淀和免疫共沉淀等操作。
注意事項(xiàng):
1、在貼壁培養(yǎng)細(xì)胞的操作步驟中,去除貼壁細(xì)胞的培養(yǎng)液后,如果血清中的蛋白沒(méi)有干擾,可以不用清洗。
2、如果裂解丌充分可以適當(dāng)增加裂解液的用量,如果需要高濃度的蛋白樣品,可以適當(dāng)減少裂解液的用量。
3、在培養(yǎng)細(xì)胞的裂解中,如果細(xì)胞量較多,必需分裝成 50~100 萬(wàn)細(xì)胞/離心管,然后再裂解。大團(tuán)的細(xì)胞較難裂解充分,而少量的細(xì)胞由于裂解液容易和細(xì)胞充分接觸,相對(duì)比較容易裂解充分。
4、如果組織樣品本身非常細(xì)小,可以適當(dāng)剪切后直接加入裂解液裂解,通過(guò)強(qiáng)烈 Vortex使樣品裂解充分。然后同樣離心取上清,用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。直接裂解的優(yōu)點(diǎn)是比較方便,不必使用勻漿器,缺點(diǎn)是丌如使用勻漿器那樣裂解得比較充分。
5、溶解 Leagene NP-40 Lysis Buffer 時(shí),應(yīng)盡量縮短溶解時(shí)間,避免裂解液中的有效成分失效。
6、細(xì)胞裂解的操作步驟,應(yīng)置于冰上或 4℃進(jìn)行。
7、為了您的安全和健康,請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。
有效期:12個(gè)月有效。

原創(chuàng)作者:青島捷世康生物科技有限公司

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