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ELISA試劑盒檢測抗生素

點擊次數(shù):3734 日期:2015/6/8 11:50:09

 

ELISA試劑盒檢測抗生素
    氨基糖類、四環(huán)素類、喹諾酮類、硝基呋喃類等。目前國內(nèi)外可以用ELISA方法檢測的抗生素有:氯霉素、鏈霉素、四環(huán)素、呋喃唑酮、呋喃它酮、呋喃妥因、恩諾沙星、泰樂菌素、磺胺喹惡啉、磺胺二甲基嘧啶、鹽霉素、磺胺類、阿維霉素、ELISA試劑盒檢測成本低靈敏度高檢測限通�?梢赃_(dá)到限量要求,是一種理想的初篩方法。但由于ELISA方法存在一定的假陽性率,因此用美聯(lián)免疫吸附法測定的陽性樣品必須做進(jìn)一步的確定實驗。
以氯霉素為例:、
    氯霉素是由委內(nèi)瑞拉鏈霉素菌產(chǎn)生的一種廣譜抗生素,也是第一種用化學(xué)合成法生產(chǎn)的抗生素。氯霉素能抑制細(xì)菌蛋白質(zhì)的合成,對革蘭氏隱形菌作用較強,敏感菌有大腸桿沙門氏菌,傷寒桿菌,副傷寒桿菌、痢疾桿菌、產(chǎn)氣桿菌、肺炎桿菌、鏈球菌、葡萄球菌、白喉桿菌、炭疽桿菌、對各種立克次氏體,原蟲及部分病毒有頂頂?shù)囊种谱饔�。氯霉素�?948年上市以來一直是治療傷副傷寒和沙門氏菌 的首選藥物。氯霉素內(nèi)服吸收良好。但注射吸收較慢,主要停滯在局部。吸收后全身分布,并聽透過血腦和胎盤屏障。大部分氯霉素在肝中與葡萄糖醛酸結(jié)合而失活,少部分降解為芳胺。約10%圓形氯霉素經(jīng)腎臟排泄,異能通過乳汁分泌。肝或腎功能障礙使消除延長,易發(fā)生蓄積中毒。
氯霉素為白色的針狀或長片狀結(jié)晶,味極苦,性能極穩(wěn)定,熔點150.5℃-151.5℃,水中微溶(0.25%),易溶于甲丙醇、乙酸乙酯等有機溶劑中,水溶劑呈中性反應(yīng),在PH10以上可失去活性。干燥晶體可以存放兩年以上,在酸堿中加熱的條件下能發(fā)生水解。氯霉素耐熱,水溶液煮沸5H也不失效,由于其結(jié)構(gòu)中有發(fā)色基團(tuán)存在,在275-280nm處有較大吸收峰,故可以直接用紫外檢測器檢測。
    氯霉素作為應(yīng)用廣泛的抗生素,曾對畜禽疾病控制和治療起到了重要作用,但由于氯霉素存在聯(lián)眾的副作用,能引起人的再生障礙性貧血,粒細(xì)胞缺乏癥等疾病,動物食品中氯霉素殘留對人類的健康構(gòu)成了巨大的威脅,氯霉素的殘留問題引起了國際組織和世界上許多國家和地區(qū)的高度重視,歐盟、美國等均在法律規(guī)定氯霉素殘留限量標(biāo)準(zhǔn)為零容許量,即不得檢出,我國農(nóng)業(yè)部2002年12月發(fā)布的《動物性食品中獸藥最高殘留限量》中規(guī)定氯霉素的容量為不得檢出。
    現(xiàn)現(xiàn)在已ELISA試劑盒檢測為例介紹;本試劑盒適用于牛奶、肉類、魚、蝦、血清、及蜂蜜中的氯霉素殘留量的測定。
(一)測定原理
    測定的基礎(chǔ)是抗原抗體放映。微孔板包被有針對兔IgG(氯霉素抗體)的羊抗體。加入氯霉素抗體、氯霉素標(biāo)記物、標(biāo)準(zhǔn)或樣品溶液、游離氯霉素與氯霉素酶標(biāo)記物競爭氯霉素抗體,同時氯霉素抗體與羊抗體連接。沒有連接的酶標(biāo)記物在洗滌步驟中被去除。將酶基質(zhì)(過氧化尿素)和發(fā)色劑(四甲基聯(lián)苯胺)加入到空中并且孵育。結(jié)合的酶標(biāo)記物將無色的發(fā)色劑轉(zhuǎn)化為藍(lán)色的產(chǎn)物。加入反應(yīng)停止液后使眼色由藍(lán)色轉(zhuǎn)變?yōu)辄S色。在450nm處測量,吸收光強度與樣品中的氯霉素濃度成正比
(二)試劑盒指標(biāo)
特異性
       通過對形影的物質(zhì)進(jìn)行交叉反應(yīng)性分析得到
       氯霉素    100%    氯霉素堿  0.5%  甲砜霉素  <0.05%
       余四環(huán)霉素  慶大霉素  變暗霉素 無交叉反應(yīng)
回收率
       牛奶>80%   魚蝦肉>80% 
       蜂蜜>80%   蛋類>80% 
(三)提供的試劑
1、96孔(12條*8孔)包被有氯霉素羊抗體。
2、濃縮標(biāo)準(zhǔn)液;為氯霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液。
3、過氧化物酶標(biāo)記的氯霉素濃縮液:0.7mL
4、氯霉素抗體濃縮液0.7ml
5、基質(zhì)(7ml)含有氧化尿素
6、四甲基聯(lián)苯胺(TMB)30%過氧化氫,牛血清白蛋白,圖文20等
7、反應(yīng)停止液1mol/L硫酸
8、緩沖液1:100ml用于標(biāo)準(zhǔn) 酶標(biāo)記物 抗體 樣品稀釋
9、緩沖液2:1ml,用于測定牛奶樣品時的標(biāo)準(zhǔn)稀釋用緩沖液
(四)試劑
1乙酸乙酯
2、異辛烷/三氯甲烷(氯仿):(2:3)
3、Carrez I :0.36mol/L  亞鐵qinghua鉀(II)`3H2O
4、Carrez I I:1.04mol/L硫酸鋅·7H2O
5、PBS緩沖液:0.55gNaH2PO4·H2O+2.85gNaH2PO4·2H2O+9gNaCl加入蒸餾水至1000ml:ph702
(五)
奶樣:
1、取5ml樣品支玻璃離心管。
2、4-12℃3500g離心15min如果沒有冰凍離心機可預(yù)先將樣品冷卻到8℃
3、轉(zhuǎn)移上層液至新離心管中。
4、取50微升進(jìn)行測定
  稀釋倍數(shù) 1  
  檢測下限50ng/kg
  定量檢測限150ng/kg
牛奶
1、取5ml樣品支玻璃離心管。
2、15℃、3000r/min離心10min
3、3ml上清液與3ml蒸餾水混合,加入250ulCarrez I及250ulCarrez II和4.5ml乙酸乙酯混合10min
4、15℃、3000r/min離心10min
5、將乙酸乙酯層轉(zhuǎn)移至另一瓶中干燥
6、用1.5ml緩沖液I溶解干燥的殘留物,加入1.5ml正乙烷混合。
7、完全除去正乙烷相
8、取出50微升水相驚醒分析
ELISA試劑盒 
 ELISA試劑盒
ELISA試劑盒ELISA試劑盒ELISA試劑盒
 
    以百分吸光度值為縱坐標(biāo),對應(yīng)氯霉素濃度(ng/kg)的對半數(shù)值為橫坐標(biāo)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線,教正曲線在50ng/kg-1350ng/kg范圍內(nèi)為線性,相對應(yīng)每一個樣品的濃度(ng/kg)可以從教正曲線上讀出,為了獲得樣品中的氯霉素實際濃度(ng/kg),從教正曲線上讀出的濃度值必須誠意相對應(yīng)的析濕系數(shù)。
 
 

原創(chuàng)作者:青島捷世康生物科技有限公司

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