高效液相色譜法的應(yīng)用

高效液相色譜法(HPLC)因具有高壓、高速、高效、高靈敏度等特點(diǎn)，并且隨著一系列衍生化方法的開發(fā)使用，尤其對非揮發(fā)性物質(zhì)，其應(yīng)用以越來越廣。與經(jīng)典的液相色譜相比它具有以下優(yōu)點(diǎn)：

（一）速度快

通常分析一個(gè)樣品需要15-20分鐘，有些樣品甚至在5分鐘之內(nèi)即可完成一次分析。

（二）分辨率高

可選擇固定相和流動相已達(dá)到最佳分離效果。

（三）靈敏度高

可采用不同的檢測器已達(dá)到所需靈敏度要求。通常紫外檢測器可達(dá)到10g，熒光和化學(xué)檢測器可達(dá)10g。

（四）

用一根色譜柱可分離不同的化合物，使用后珠子也可能變壞，這取決于樣品的類型、溶劑的性質(zhì)和操作的情況。

（五）樣品容易回收

樣品經(jīng)過色譜柱后不被破壞，可以收集單一組分或做制備。

用高效液相色譜法（HPLC）對樣品進(jìn)行分析之前，首先必須建立適合該樣品分析的方法；即依據(jù)樣品的來源、性質(zhì)、進(jìn)行適當(dāng)?shù)奶幚砗�，選擇合適的色譜柱和流動相及檢測器對樣品進(jìn)行分析。

1、樣品的性質(zhì) 樣品中待測組分的分子量大小、化學(xué)結(jié)構(gòu)、溶解性等化學(xué)、物理性質(zhì)決定著色譜分離類型的選擇。對樣品的性質(zhì)分析是建立方法的前提。

若樣品組成縫份簡單時(shí)，可直接進(jìn)行分析，只要待測組分可與其他成分分開即可。

當(dāng)組成成分復(fù)雜干擾待測組分測定時(shí)，必須對樣品進(jìn)行純化處理，或除去干擾組分或提取待測組分。尤其是生物樣品的分析往往必須經(jīng)過適當(dāng)?shù)念A(yù)處理后才能分析待測組分。

2、色譜分離類型的選擇 高效液相色譜法（以下檢測HPLC）中色譜柱和流動相的選擇必須依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的性質(zhì)。

3、溶劑的選擇與處理 流動相溶劑要求純度高；粘度��；對樣品有適宜的溶解度；不引起注銷損失且與檢測器相匹配。使用前溶劑必須進(jìn)行純化和脫氣處理。

HPLC分析時(shí)通常采用混合溶劑提高分離選擇性。HPLC流動相系統(tǒng)中的PH值范圍一般為2.5-7.5，因此溶劑系統(tǒng)往往采用低濃度的緩沖溶液，最常用的緩沖溶液時(shí)醋酸鹽和磷酸鹽緩沖液。由于該類緩沖液溶液易發(fā)霉，因此最好現(xiàn)用現(xiàn)配或置冰箱貯存�！�

在分析復(fù)雜樣品時(shí)可采用梯度洗脫方法，即按一定程度連續(xù)或間斷改變流動相的組成使色譜分離效率提高，峰型改善，分析速度加快。

4、檢測器的選擇 在HPLC檢測中，當(dāng)樣品有紫外吸收時(shí)，常選用紫外檢測器。當(dāng)樣品本生或經(jīng)過衍生化反應(yīng)后能夠產(chǎn)生熒光時(shí)常選用熒光檢測器。電化學(xué)檢測器使用于氧化還原性的物質(zhì)檢測。熒光或電化學(xué)檢測器可使檢測靈敏度提高2-3個(gè)數(shù)量級。

中國藥典從1985年開始收載1HPLC方法，只有七個(gè)項(xiàng)目，全部用于含量測定；后來HPLC在藥典中的收載項(xiàng)目不斷增多，不僅用于含量測定，也用于鑒別和雜質(zhì)檢查等。1990年版藥典收載中鑒別9項(xiàng)，雜質(zhì)檢測12項(xiàng)，含量測定達(dá)到55項(xiàng)；1995年版藥典收載集聚增加，鑒別34項(xiàng)，檢查48項(xiàng)，含量測定104項(xiàng)。

原創(chuàng)作者：青島捷世康生物科技有限公司