酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定
目的要求
1、學(xué)習(xí)酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定原理
2、掌握酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定技術(shù)，定量測(cè)定抗體或抗原。
實(shí)驗(yàn)原理
1971年，Engvall和Perlmann發(fā)表了酶聯(lián)免疫吸附劑測(cè)定（enzyme linked immunosor-bent assay，ELISA）用于IgG定量測(cè)定的文章，使得1966年開(kāi)始用于抗原定位的酶標(biāo)抗體技術(shù)發(fā)展成液體標(biāo)本中微量物質(zhì)的測(cè)定方法。這一方法的基本原理是：使抗原或抗體結(jié)合到某種固相載體表面，并保持其免疫活性。再使抗原或抗體與某種酶鏈接成酶標(biāo)抗原或抗體，這種酶標(biāo)抗原或抗體即保留免疫活性，又保留酶的活性。在測(cè)定時(shí)，把受檢標(biāo)本（測(cè)定其中的抗體或抗原）和酶標(biāo)抗原或抗體按不同的步驟與固相載體表面的抗原或抗體起反應(yīng)。用洗滌的方法使固相載體上形成的抗原體復(fù)合物與其他物質(zhì)分開(kāi)，最后結(jié)合在固相載體上的酶量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量成一定的比例。加入酶反應(yīng)的底物后，底物被酶催化變?yōu)橛猩a(chǎn)物，產(chǎn)物的量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量直接相關(guān)，故可根據(jù)顏色反應(yīng)的深淺定性或定量分析。由于酶的催化頻率很高，故可極大地地放大反應(yīng)效果，從而使測(cè)定方法達(dá)到很高的敏感度。
根據(jù)檢測(cè)目的的不同可將ELISA分為一下幾型：
（1）、直接法。將抗原吸附在載體表面，加酶標(biāo)抗體，形成抗原一抗體復(fù)合物，加底物。底物的降解量=抗原量。
（2）、間接法。將特異性抗原與固相載體鏈接形成固抗相抗原。清晰除去未結(jié)合抗原。加入受檢標(biāo)本使之與固相抗原結(jié)合（樣品中特異性抗體與固相抗原結(jié)合，形成固相抗原-抗體復(fù)合物）。清晰除去其他未結(jié)合的物質(zhì)。加入酶標(biāo)記抗免疫球蛋白（抗抗體，二抗），它與固相復(fù)合物中的抗體結(jié)合。固相載體上的酶量就代表特異性抗體的含量。加入底物顯色，在20～60min內(nèi)觀(guān)察顯色結(jié)果。酶催化底物變?yōu)橛猩a(chǎn)物，根據(jù)顏色反應(yīng)的深度進(jìn)行抗體的定性或定量檢測(cè)。
（3）、雙抗體夾心法。將特異性抗體與固相載體鏈接即包被，形成固相抗體。清洗除去未結(jié)合的抗體。加入受檢標(biāo)本使之與固相抗體結(jié)合（樣品中特異性抗原與固相抗體結(jié)合，形成固相抗原-抗體復(fù)合物）。清洗除去其他未結(jié)合的物質(zhì)。加入酶標(biāo)記抗體。固相免疫復(fù)合物上的抗原就可以與酶標(biāo)記抗體結(jié)合。加入底物顯色，在20～60min內(nèi)觀(guān)察顯色結(jié)果。酶催化底物變?yōu)橛猩a(chǎn)物，根據(jù)顏色反應(yīng)的深度進(jìn)行抗原的定性或定量檢測(cè)。本法只適用于二價(jià)或二價(jià)以上大分子抗原，而不適用于半抗原的檢測(cè)。
（1）、競(jìng)爭(zhēng)抑制法。將特異性抗原與固相載體鏈接形成固相抗原。清洗除去未結(jié)合的抗原。同時(shí)加入受檢標(biāo)本和抗原使之與固相抗原競(jìng)樣品中特異性抗體與固相抗原和游離的抗原競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合，形成固相抗原-抗體和游離的抗原-抗體結(jié)合（抗體復(fù)合物）。清洗除去其他未結(jié)合的物質(zhì)和游離的抗原-抗體復(fù)合物。加入酶標(biāo)記抗免疫球蛋白（抗抗體，二抗），它與固相復(fù)合物中的抗體結(jié)合。固相載體上的酶量就代表特異性抗體的含量。加入底物顯色，在20～60min內(nèi)觀(guān)察顯色結(jié)果。酶催化底物變?yōu)橛猩a(chǎn)物，根據(jù)顏色反應(yīng)的深度進(jìn)行抗體的定性或定量檢測(cè)。
試劑和器材
（1）、試劑
辣根過(guò)氧化物酶兔抗鼠IgG，工作稀釋度1:1000。
包被液：0.05mol/L，PH9.6碳酸緩沖液，4℃，保存，Na2CO3,0.15g，NaHCO3，0.293g，蒸餾水稀釋至100mL。
稀釋液及洗滌液：0.01mol/L，pH7.4 PBS-Tween-20,4℃保存，NaCI ,8g，KH2PO4，0.2g，Na2HPO4·12H2O，2.9g，Tween-20，0.5mL，蒸餾水加至1000mL。
封閉液：0.5%雞卵清蛋白，pH7.4PBS。
鄰苯二胺溶液（底物）：臨用前配，0.1mol/L，檸檬酸（2.1g/100mL）6.1mL，0.2mol/L，Na2HPO4·12H2O（7.163g/100mL）6.4mL，蒸餾水12.5mL，鄰苯二胺10mg，溶解后，臨用前加30% H2O2，40uL。
終止液：2mol/L，H2so4。
（2）、材料
取一定量的甲胎球蛋白免疫兔制備抗血清。陰性對(duì)照血清。
（3）、器材
聚苯乙烯微量反應(yīng)板（40孔或96孔），可調(diào)試微量吸液器（200uL），封口膜小燒杯，試管，37℃恒溫箱，酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀。
操作方法
（1）、包被抗原。用包被液將抗原作適當(dāng)稀釋?zhuān)话銥?～10ug/孔，每孔加200uL，37℃溫育1h后，4℃冰箱放置16～18h。
（2）、洗滌。倒盡板孔中液體，加滿(mǎn)洗滌液，靜放3min，反復(fù)3次，最后將反應(yīng)板倒置在吸水紙上，使孔中洗滌液流盡。
（3）、加封閉液200uL，37℃放置1h。
（4）、洗滌同（2）。
（5）、加被檢血清。用稀釋液將被檢血清作幾種稀釋?zhuān)靠?00uL。同時(shí)作稀釋液對(duì)照。37℃放置2h。
（6）、洗滌同（2）。
（7）、加辣根過(guò)氧化物酶鼠抗兔IgG，每孔200uL，37℃放置1h。
（8）、洗滌同（2）。
（9）、加底物。鄰苯二胺溶液加200mL，室溫暗處10～15min。
（10）、加終止液：每孔50uL。
（11）、觀(guān)察結(jié)果：用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀記錄490nm讀數(shù)。
注意事項(xiàng)
（1）、酶標(biāo)記抗體以及待檢樣本的使用濃度應(yīng)事先滴定。
（2）、保存的血清切忌反復(fù)凍融，以免降低血清中抗體或抗原的免疫學(xué)活性。
（3）、酶-底物反應(yīng)時(shí)間除人為規(guī)定（常規(guī)規(guī)定為30min）外，還可以陽(yáng)性參考標(biāo)本的OD值達(dá)到1.0時(shí)為反應(yīng)終點(diǎn)。
（4）、底物液一定在臨用前現(xiàn)配。
原創(chuàng)作者：青島捷世康生物科技有限公司
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