免疫熒光標(biāo)本的制備
細(xì)胞標(biāo)本的制作 根據(jù)實驗對象不同而采用不同的方法，但最終均要使樣品純凈，盡量減少雜質(zhì)及碎片，并調(diào)整樣品濃度為1×106細(xì)胞。唯外周血細(xì)胞需用白細(xì)胞分層液做梯度離心，取中間層洗凈、計數(shù)應(yīng)用，這是當(dāng)前實驗室常規(guī)。盡管大約有10%以下的單核細(xì)胞污染，在感染病人或懷孕婦女的血樣品污染甚至高達(dá)20%，目前淋巴細(xì)胞免疫分型研究中，還是最理想的標(biāo)本制作法。有人企圖用多種手段去除單核細(xì)胞或紅細(xì)胞，如貼附法，即外周血置塑料瓶內(nèi)37℃培養(yǎng)1小時，取上清內(nèi)的細(xì)胞，其結(jié)果造成細(xì)胞產(chǎn)量降低，T細(xì)胞百分比增加，B細(xì)胞比列下降。用吞噬法，即抗凝外周血加5%矽（Silica），37℃1小時，再用Ficol分離，也會形成淋巴細(xì)胞產(chǎn)率低，B細(xì)胞比例少，T細(xì)胞上升，同時矽也會造成細(xì)胞熒光強(qiáng)度增加。NH4CI3處理紅細(xì)胞也會影響T淋巴細(xì)胞亞群的百分?jǐn)?shù)。因此，在外周血標(biāo)本制作過程中，細(xì)胞分離程序不宜太復(fù)雜，否則會影響亞群的分布關(guān)系。當(dāng)然，任骨髓標(biāo)本的制作時，也要充分考慮骨髓的吸收及處理方法，不然會形成系統(tǒng)誤差。
免疫熒光染色方法
直接染色法：熒光色素直接交聯(lián)抗體。1、1×106細(xì)胞于尖底離心管內(nèi)，加熒光標(biāo)記抗體，4℃放置15—30分鐘。如做雙標(biāo)記染色，可把兩種抗體直接加入。2、冷20%小牛血法，0.1%NaN3 1/15M PBS（PH4.4）洗細(xì)胞2次加入適量緩沖液待測。
間接染色法：1、1×106細(xì)胞加特異的第一抗體，4℃15—30分鐘。2、加緩沖液洗2次，吸盡殘留液體，彈起沉淀，加入熒光標(biāo)記的第二抗體，4℃30分鐘。3、緩沖液洗2次，加適量液體待測。全部操作盡量在4℃或水浴中進(jìn)行，減少無關(guān)因素干擾。
直接染色法敏感性比間接稍差，但操作簡單，適用同一細(xì)胞群體的多種標(biāo)記的同時測定。
染色中的注意事項1、為減少非特異性干擾，熒光標(biāo)記物用前應(yīng)該用0.22um濾膜過濾或20000—50000g離心5分鐘，去除顆粒或沉渣。2、為增加敏感性，可用三步間接染色法，即細(xì)胞加鼠單克隆抗體加羊抗鼠Ig血法+FITC兔抗羊IgG F（ab’）。此舉可測到常規(guī)兩步法查不到的抗原成分，但因?qū)哟渭佣啵彩芊翘禺愋员尘跋拗啤?、某些細(xì)胞帶有Fc受體，可同試劑非特異結(jié)合，用F（ab’）片段可解決此問題。人的單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、粒細(xì)胞所含F(xiàn)c受體都比T、B、NK細(xì)胞多，而后者的親和力也低，可用調(diào)整抗體種類來克服。因有人認(rèn)為鼠抗體對人血細(xì)胞的Fc受體非特異性結(jié)合順序是IgG2>IgG1>IgM，而兔抗體的非特異性結(jié)合比羊抗體強(qiáng)。4、細(xì)胞標(biāo)本的制備、染色及保存都應(yīng)盡量保持新鮮，防止調(diào)變或分解代謝引起的表面抗原消失及細(xì)胞死亡，可通過加入營養(yǎng)培養(yǎng)基、低濃度血清、0.1%NaN3、4℃或冰浴中操作來解決。5、在稀少細(xì)胞或比例低的細(xì)胞亞群分析時，為保證準(zhǔn)確、應(yīng)排除死細(xì)胞。
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