過(guò)氧化氫含量（H2O2）試劑盒說(shuō)明書(shū)
分光光度法 50 管/48 樣
測(cè)定意義：
H2O2 是生物體內(nèi)最常見(jiàn)的活性氧分子，主要由 SOD 和 XOD 等催化產(chǎn)生，由 CAT 和 POD 等催化降解。H2O2 不僅是重要的活性氧之一，也是活性氧相互轉(zhuǎn)化的樞紐。一方面，H2O2可以直接或間接地氧化細(xì)胞內(nèi)核酸，蛋白質(zhì)等生物大分子，并使細(xì)胞膜遭受損害，從而加速細(xì)胞的衰老和解體；另一方面 H2O2 也是許多氧化應(yīng)急反應(yīng)中的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，。
測(cè)定原理：
H2O2 與硫酸鈦生成黃色的過(guò)氧化鈦復(fù)合物，在 415nm 有特征吸收。
需自備的儀器和用品：
可見(jiàn)分光光度計(jì)、臺(tái)式離心機(jī)、可調(diào)式移液器、1 mL 玻璃比色皿、丙酮 60mL、濃鹽酸 10mL、研缽和冰。
試劑的組成和配制：
試劑一：丙酮 60mL×1 瓶，4℃保存；（自備）
試劑二：粉劑×1 瓶，4℃保存；臨用前加入 10mL 濃鹽酸充分溶解備用。用不完的試劑 4℃ 保存；試劑三：15mL×1 瓶，4℃保存；
試劑四：60mL×1 瓶，4℃保存；
H2O2 提�。�
1、細(xì)菌或細(xì)胞樣品的制備：收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量（104 個(gè)）：
試劑一體積（mL）為 500~1000：1 的比例（建議 500 萬(wàn)細(xì)菌或細(xì)胞加入 1mL 試劑一），超聲波破碎細(xì)菌或
細(xì)胞（冰浴，功率 20％或 200W，超聲 3s，間隔 10s，重復(fù) 30 次）；用試劑一定容至 1mL；8000g 4℃離心 10min，取上清，置冰上待測(cè)。
2. 組織樣品的制備：按照組織質(zhì)量（g）：試劑一體積(mL)為 1：5~10 的比例（建議稱(chēng)取約 0.1g 組織，加入 1mL 試劑一）進(jìn)行冰浴勻漿；轉(zhuǎn)移至 EP 管中，用試劑一定容至 1mL，8000g 4℃離心 10min，取上清，置冰上待測(cè)。
3、血清（漿）樣品：直接檢測(cè)。
測(cè)定步驟：
1、分光光度計(jì)預(yù)熱 30min 以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至 415nm，蒸餾水調(diào)零。
2、將試劑二、三和四 37℃（哺乳動(dòng)物）或 25℃（其它物種）水浴 10min 以上。
3、在 EP 管中按順序加入下列試劑
| 試劑名稱(chēng)（μL） | | 測(cè)定管 | | 對(duì)照管 |
| | | | | |
| 樣本 | | 吸取的量的為全部上清液 | | |
| | | | | |
| 試劑一 | | | | 1000 |
| | | | | |
| 試劑二 | | 100 | | 100 |
| | | | | |
| 試劑三 | | 200 | | 200 |
| | | | | |
| | 4000g，常溫離心 10min，棄上清，留沉淀 | |
| | | | |
| 試劑四 | | 1000 | | 1000 |
| | | | | |
加入試劑四溶解沉淀后，室溫靜置 5min，倒入比色皿中，測(cè)定 415nm 處吸光值 A。對(duì)照管只要做一次即可。計(jì)算ΔA＝A 測(cè)定-A 對(duì)照。
注意事項(xiàng)：
1、由于試劑一易揮發(fā)，試劑一必須先預(yù)冷再加，研磨時(shí)必須在冰上研磨。
2、本試劑盒中試劑的揮發(fā)性較高，請(qǐng)帶一次性手套和口罩。
H2O2 含量計(jì)算：
1、標(biāo)準(zhǔn)條件下測(cè)定的回歸曲線(xiàn)， y = 0.062x - 0.08(x 為標(biāo)準(zhǔn)品濃度，μmol/mL；y 為ΔA)。
2、血清（漿）中 H2O2 含量的計(jì)算：
H2O2 含量（μmol/mL）＝(ΔA＋0.08)÷0.062=16.13×(ΔA＋0.08)
3、細(xì)菌、細(xì)胞或動(dòng)物組織中 H2O2 含量計(jì)算（1）按照蛋白濃度計(jì)算
H2O2 含量(μmol/mg prot)=[(ΔA＋0.08) ÷0.062×V1]÷(V1×Cpr)=16.13×(ΔA＋0.08) ÷Cpr
需要另外測(cè)定，建議使用本公司 BCA 蛋白質(zhì)含量測(cè)定試劑盒。（2）按照樣本質(zhì)量計(jì)算
H2O2 含量(μmol/g 鮮重)=[(ΔA＋0.08) ÷0.062×V1]÷(W ×V1÷V2)=16.13×(ΔA＋0.08) ÷W
(3 ) 按照細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算：
H2O2 含量(μmol/104)=[(ΔA＋0.08) ÷0.062×V1]÷(500×V1÷V2)=0.032×(ΔA＋0.08) V1：加入反應(yīng)體系中樣本體
積，1mL；V2：加入提取液體積，1mL；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g；500：細(xì)胞或細(xì)菌
總數(shù)，500 萬(wàn)。
原創(chuàng)作者：青島捷世康生物科技有限公司
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