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α-酮戊二酸脫氫酶(α-KGDH)活性測定試劑盒說明書

點擊次數(shù):1517 日期:2016/10/12 10:36:38

α-酮戊二酸脫氫酶(α-KGDH)活性測定試劑盒說明書
 
分光光度法 50 管/48 樣
 
測定意義
 
α-KGDHEC 1.2.4.2)廣泛存在于動物、植物微生物和培養(yǎng)細胞的線粒體中,是三羧酸循環(huán)調(diào)控關(guān)鍵酶之一,催化α-酮戊二酸氧化脫羧生成琥珀酰輔酶 A。
 
測定原理
 
α-KGDH 催化α-酮戊二酸、NAD+ 和輔酶 A 生成琥珀酰輔酶 A、二氧化碳和 NADH,NADH340 nm 有特征吸收

峰,以
NADH 的生成速率表示α-KGDH 活性。
需自備的儀器和用品
 
紫外分光光度計、水浴鍋、臺式離心機、可調(diào)式移液器、1mL 石英比色皿、研缽、冰和蒸餾水。
試劑的組成和配制
 
試劑一:50mL×1 瓶,-20℃保存;
 
試劑二:10mL×1 瓶,-20℃保存;
 
試劑三:1mL×1 支,-20℃保存;試劑四:液體 55.5mL×1 瓶,4℃保存;試劑五:粉劑×1 支,4℃保存;試劑六:粉劑×1 支,4℃保存;試劑七:粉劑×1 支,4℃保存;試劑八:粉劑×1 支,4℃保存;試劑九:粉劑×1 支,-20℃保存;
 
試劑十:粉劑×1 支,-20℃保存;臨用前加入 2.1mL 蒸餾水充分混勻待用,用不完的試劑仍-20℃保存。
 
工作液的配制:臨用前把試劑五、試劑六、試劑七、試劑八和試劑九轉(zhuǎn)移到試劑四中混合溶解待用。
 
樣本的前處理:
 
組織、細菌或細胞中胞漿蛋白與線粒體蛋白的分離:
 
1、稱取約 0.1g 組織或收集 500 萬細胞,加入 1mL 試劑一和 10uL 試劑三,用冰浴勻漿器或研缽勻漿。
 
2、將勻漿 600g,4℃離心 5min。
 
3、棄沉淀,將上清液移至另一離心管中,11000g,4℃離心 10min。
 
4、上清液即胞漿提取物,可用于測定從線粒體泄漏的α-KGDH(此步可選做)。
 
5、在步驟的沉淀中加入 200uL 試劑二和 2uL 試劑三,超聲波破碎(冰浴,功率 20%或200W,超聲 3 秒,間隔 10 秒,重復(fù) 30 次),用于線粒體α-KGDH 活性測定。
 
測定步驟
 
1、分光光度計預(yù)熱 30min 以上,調(diào)節(jié)波長至 340nm 處,蒸餾水調(diào)零。
 
2、工作液于 37℃(哺乳動物)或 25℃(其它物種)孵育 5min
 
3、在 1mL 石英比色皿中依次加入 40μL 試劑十、60μL 樣本和 1.1mL 工作液,混勻,立即記錄 340nm 處 20s 的吸光值 A1 和 2min20s 時的吸光值 A2,計算ΔA=A2-A1。
α-KGDH 活性計算
 
1) 按樣本蛋白濃度計算
 
單位的定義:每 mg 組織蛋白每分鐘生成 1 nmol 的 NADH 定義為一個酶活力單位。
 
α-KGDH 活性(U/mg prot)=[ΔA×V 反總÷ε×d×109]÷(V ×Cpr) ÷T=1608×ΔA÷Cpr
 
2) 按樣本鮮重計算:
 
單位的定義:每 g 組織在反應(yīng)體系中每分鐘生成 1 nmol 的 NADH 定義為一個酶活力單位。
 
α-KGDHU/g 鮮重)=[ΔA×V 反總÷ε×d×109]÷(W× V ÷V 樣總) ÷T=325×ΔA÷W
 
3) 按細菌或細胞密度計算:
 
單位的定義:每 1 萬個細菌或細胞每分鐘生成 1 nmol 的 NADH 定義為一個酶活力單位。
 
α-KGDH 活性(U/104 cell)=[ΔA×V 反總÷ε×d×109]÷(500×V ÷V 樣總) ÷T=0.65×ΔA V 反總:反應(yīng)體系總體積,1.2×10-3 LεNADH 摩爾消光系數(shù),6.22×103 L / mol /cm;d
 

比色皿光徑,
1cm;V 樣:加入樣本體積,0.06 mL;V 樣總:加入提取液體積,0.202 mL;T:反應(yīng)時間,2minCpr:樣本蛋白質(zhì)濃度,mg/mL;W:樣本質(zhì)量,g;500:細菌或細胞總數(shù),500 萬。

原創(chuàng)作者:青島捷世康生物科技有限公司

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