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染色方法有哪幾種

點(diǎn)擊次數(shù):2972 日期:2019/8/5 16:55:42

  

染色方法有哪幾種

 

蛋白質(zhì)-DNA染色法

  試劑  碘化丙啶100ug/ml,FITC  50ug/ml,PBS-EDTA:含EDTA 174mg/mlPBSRNA1mg/1ml,需加熱至90℃以上30分鐘去除DNA酶。

   操作步驟  取70%冷乙醇固定的細(xì)胞(至少固定12小時(shí)以上)12×106/ml,離心,用PBS洗一次,加RNA100ul,37℃消化30分鐘。加1ml  PBS-EDTA液,及FITC20ul,混勻,避光,置室溫中5分鐘,加PI 1ml,混勻。避光,置室溫中10分鐘后上機(jī)測(cè)定。

吖啶橙(AO)染色法

    注意事項(xiàng)  所用AO必須是Polysciences CO.產(chǎn)品,AO濃度應(yīng)在516ug/ml。推薦用以70%冷乙醇固定的小鼠胸腺細(xì)胞為標(biāo)準(zhǔn)樣品。以確定不同型號(hào)FCM需用的最佳AO濃度。以RNA為橫坐標(biāo),DNA為縱坐標(biāo)時(shí)最佳圖型應(yīng)呈~型,上、下線應(yīng)平行,不傾斜。凡測(cè)試標(biāo)本前先以小鼠胸腺標(biāo)本檢驗(yàn)儀器狀態(tài)。

   AO染液易污染管道,每次實(shí)驗(yàn)結(jié)束后需用漂白粉或清潔液沖洗管道,再用蒸餾水生理鹽水長(zhǎng)時(shí)間沖洗,以使AO染液沖洗凈。

免疫抗體標(biāo)記與DNA雙染色法

    操作步驟  血或骨髓用比重為1.077g/ml淋巴細(xì)胞分層液分離單個(gè)核細(xì)胞。如分層后仍含有較多的紅細(xì)胞,則可用0.83% NH4CI溶液,以3倍于細(xì)胞懸液量,15℃混勻15分鐘�;蛴谜麴s水溶解30秒鐘后立即加2倍量的1.8%生理鹽水以去除紅細(xì)胞。免疫標(biāo)記的標(biāo)本應(yīng)含90%以上的活細(xì)胞。調(diào)整細(xì)胞濃度至1×107/ml。取50ul細(xì)胞懸液加第一抗體,混勻后置43060分鐘。用PBS洗細(xì)胞2次。再加第二抗體,混勻后置4℃ 3060分鐘再用PBS洗細(xì)胞2次,加入約1ml PBS,即可上機(jī)測(cè)定�;�?qū)⒓?xì)胞固定于2ml 70%冷乙醇或0.5%多聚甲醛。避光保存于4℃。熒光強(qiáng)度可保持10天不衰老減。標(biāo)記后的新鮮細(xì)胞或固定細(xì)胞均可再用RNA100ul1mg/ml)于37℃中消化30分鐘,加PI 1ml100ug/ml)混勻,10分鐘后上機(jī)檢測(cè)。

DNA與ras基因蛋白檢測(cè)法

    取1.5×106細(xì)胞,固定于1ml 100%冷甲醇中,充分振搖后置于—20℃至少10分鐘。離心沉淀,棄上清液。用不含鈣、鎂的HBSSPBS洗細(xì)胞一次,離心,棄上清液、留約50ul。再加50ul PBS(含1%牛血清白蛋白)及1%羊血清,混合后置室溫中30分鐘。加50ulras MoAb(用含1% BSAPBS,198稀釋?zhuān);靹蚝螅帽?span style="font-family: Calibri;">30分鐘。用PBS洗兩次。留約50ul上清液,加50ul FITC-兔抗大鼠抗體(該抗體需用PBS1:10稀釋?zhuān)靹蚝�,置冰�?span style="font-family: Calibri;">30分鐘。用PBS洗兩次,加250ul RNA酶(500u./ml)混勻,置37℃避光保溫30分鐘,再加250ul PI50ug/ml)混勻,10分鐘后上機(jī)測(cè)定。或可加第三抗體,即FITC標(biāo)記的羊抗兔抗體,以增強(qiáng)FITC熒光強(qiáng)度。

PCNA與DNA雙染色法

    1×106細(xì)胞,用1%多聚甲醛及20ug/ml Lysolecithin PBS 1ml固定2分鐘。立即離心沉淀(5000rpm,1分鐘),棄上清液,輕輕振蕩沉淀物。加100%甲醇1ml,置—205分鐘,離心沉淀,棄上清液。加含0.1% NP40PBS  1ml,混勻,置冰上5分鐘。加第一抗體200ulPCNAPBS 1:100稀釋?zhuān)�。�?duì)照用Coulter IgG 5ulPBS 195ul,混勻,置室溫10分鐘。離心沉淀,加第二抗體FITC-羊抗鼠IgG  200ul混勻放置10分鐘。離心沉淀,加PI 500ul50ul/ml),1000u  RNA酶,混勻后置室溫20分鐘后測(cè)定。

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