革蘭鑒別染色法
點擊次數(shù)：1123 日期：2015/9/17 9:41:49
微生物染色方法一般分為單染色法、復(fù)染色法、特殊染色法及負(fù)染色法。單染色法是用一種染料使微生物染色，但不能鑒別微生物；復(fù)染色法則采用兩種或兩種以上的染料，將不同微生物染成不同顏色以鑒別微生物，常用的有革蘭染色法和抗酸染色法；負(fù)染色法則使微生物背景著色；特殊染色法可將細菌各部分結(jié)構(gòu)染成特定顏色。實驗材料方法一 革蘭鑒別染色法1．菌種：大腸桿菌，枯草桿菌(經(jīng)20h培養(yǎng)的肉汁斜面或平板培養(yǎng)物)革蘭染色各步驟的作用及結(jié)果為革蘭染色程序表。 革蘭染色程序操作步驟和使用的試劑處理時間
與細胞所起的反應(yīng)鏡檢細胞觀察到
的現(xiàn)象革蘭陽性細菌(G+)革蘭陰性細菌(G—)涂片與火焰固定細胞蛋白質(zhì)疑固與革蘭陽性菌相同無色甲紫染色45—60s1．染料為細胞吸附，
以結(jié)合和不結(jié)合
兩種形式吸附2．細胞成紫色與革蘭陽性菌相同紫色碘液染色(媒染)1rain1．碘反應(yīng)，即可能固
定結(jié)合或不結(jié)合
甲紫2．形成一種碘甲紫
復(fù)合沉淀物3．細胞仍為紫色與革蘭陽性菌相同紫色脫色(乙醇或乙醇丙酮混合物)小心地一滴一滴地點到標(biāo)本上，直到不出現(xiàn)紫色液溢出1．脫色液引起碘甲
紫復(fù)合物離解2．復(fù)合物的成分成
為可溶性3．厚的細胞壁呈現(xiàn)
脫水4．染料的擴散慢慢
進行l(wèi)，2．與革蘭陽性菌
相同3．薄的細胞鞘呈現(xiàn)
脫水4．染料的擴散很快
進行革蘭陽性紫色革蘭陰性無色復(fù)染(蕃紅或稀的石炭酸復(fù)紅)0．5一lmin1．稍有出現(xiàn)甲紫被
取代，但總的細胞
群不受影響2．細胞呈現(xiàn)紫色或
紅色1．原甲紫染色部位
被取代2．細胞被復(fù)染3．細胞呈紅色革蘭陽性紫色革蘭陰性紅色
在進行革蘭染色中有時結(jié)果不穩(wěn)定，主要的原因是脫色時間掌握不當(dāng)，涂片太厚，或菌齡太長，一般采用20—24h的培養(yǎng)物。染色操作步驟及注意點
從革蘭染色法可以看到染色操作包括制片、固定、染色、媒染、脫色、復(fù)染、水洗、干燥等步驟，每一步都具有其操作要點和注意點，若不當(dāng)心，可能就得不到滿意的結(jié)果。
1．制片：制片要采用干凈的載玻片，并注意接種環(huán)的無菌操作。做斜面菌體片時，要防止菌體和水混合不均勻有結(jié)團現(xiàn)象，注意菌體量適中。
2．固定：涂片后最好先在室溫下自然干燥，然后固定。固定的目的是：①殺死微生物，固定其細胞結(jié)構(gòu)；②保證菌體能牢固地黏附在載玻片上，因而可防止標(biāo)本被沖洗掉；③改變菌體對染料的通透性，一般使死細胞原生質(zhì)染色。
(1)固定常用高溫，手執(zhí)載玻片一側(cè)，標(biāo)本面朝上，在火焰外層快速來回通過3—4次。共約3—4s，要求玻面溫度不超過60~C，此時以手背皮膚接觸不覺過燙為度。放置待冷后染色。由于熱固定會改變細胞的內(nèi)部結(jié)構(gòu)及外形，所以研究菌體細胞結(jié)構(gòu)時常采用化學(xué)固定法。 、
(2)常用的化學(xué)固定劑有：95％乙醇、乙醇和醚1：l的混合液、丙酮、l％一2％餓酸液。適用于固定絲狀菌的固定液介紹兩種：①鉻酸一醋酸一餓酸液：鉻酸坨，冰醋酸坨，l％餓酸lml；②鉻酸一醋酸一甲醛溶液：1％鉻酸80ral，冰醋酸5ml，甲醛溶液15ml。
鋨酸能很快固定細菌細胞而不改變其結(jié)構(gòu)，因此用它來固定微生物細胞很方便。
3．媒染與染色：標(biāo)本固定以后，滴加染色液，使整個標(biāo)本固定在染色液中。染色時間視標(biāo)本與染料的性質(zhì)而定，有時還需加熱。一般染色時間為l一3rain。
如作復(fù)合染色，要在染色前作媒染處理。媒染劑與染料能形成不溶性的化合物，它能增加染料和細胞的親和力(表12—3)。媒染一般在固定后進行，但也可結(jié)合固定或染色同時進行。表12-3 各種媒染劑的作用媒染液名稱 作 用醋酸(少量)氯化鋇(2％一4％)硅鎢酸(4％水溶液)碳化鏗(少量)碘和苦味酸增加曙紅、胭脂紅的染色酸性染色劑的染色堿性染色劑的染色增進減性染料染色各種紫色染媒，染色后用
4．脫色與復(fù)染：一般脫色都用醇類和酸類處理，通常可以檢查染料與細胞結(jié)合的程度。用以鑒定菌類，常見的脫色劑是95％的乙醇，3％的鹽酸液。
脫色后需再用一種染色劑染色，它能與脫色的部分形成鮮明對比，便于區(qū)別觀察。革蘭染色中可以用萎紅液或石炭酸品紅等作復(fù)染液。
5．水洗與干燥：染色時間一到，就應(yīng)用細小的緩流水將多余染料從標(biāo)本上洗去，但不要將細胞所吸附的染料洗去。洗凈后，將標(biāo)本放置桌上風(fēng)干，也可用吸水紙輕輕吸去水分。有時也可微微加熱，待干后再鏡檢。
6．標(biāo)本玻片的封藏：標(biāo)本鏡檢后，有時需要長期保存，這時應(yīng)將標(biāo)本封存。常用的制片黏著劑是加拿大膠，其制法是：混合等量的干加拿大膠和碳酸氫鈉在乳缽內(nèi)磨碎，加入等量二甲苯，制成透明溶液，約l周后過濾，并微熱，使溶液具適當(dāng)稠度。保存在暗處，并外涂黑色。將此液滴加到標(biāo)本中，上蓋清潔蓋玻片，壓平，待干，保存。用此種中和性的加拿大膠保藏標(biāo)本，不易褪色。
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