實(shí)驗(yàn)窄制備單核苷酸一般用化學(xué)水解法(酸、堿水解)和酶解法。RNA用酸水解可得到嘧啶核苷酸和嘌呤堿基；用堿水解可得到2’～核苷酸和3’～核苷酸的混合物(比例2；3)；用5L磷酸二一酯酶或3L磷酸二i酯酶水解則分別可得到5’一核苷酸或3’一核苷酸本實(shí)驗(yàn)采用堿水解法。一般情況下磷酸二酯鍵對(duì)堿是比較穩(wěn)定的，但由于RNA分子中核糖的2’羥基的鄰接基團(tuán)效應(yīng)，使RNA分子中的磷酸二酯鍵變得對(duì)堿不穩(wěn)定，因此，RNA可以用堿水解，經(jīng)過2’，3’一環(huán)核苷酸中間物，生成2L核苷酸和3’一核苷黢。堿水解的方法很簡(jiǎn)單，一般用0．3N KOH，37℃保溫18小時(shí)就能水解完全。水解畢，用高氯酸HCl0。中和，，{三成高氯酸鉀KCl0。沉淀，離心去除沉淀，上清液即為各單核苷酸的混合液。成溶解度較大的高氯酸鈉，使水解液中的鈉離子無法除去。當(dāng)水解液中的單核苷酸與離子交換樹脂上的活性基團(tuán)進(jìn)行交換反應(yīng)時(shí)，鈉離子將與單核苷酸起競(jìng)爭(zhēng)作用，影響單核苷酸交換反應(yīng)的進(jìn)行。而使用氫氧化鉀，則中和水解液時(shí)生成的高氯酸鉀溶解度小，產(chǎn)生沉淀，容易離心除去。氫氧化鉀應(yīng)在臨用前配制，因?yàn)闅溲趸�鉀溶液久置�?huì)吸收空氣中的二氧化碳生成碳酸鹽。碳酸鹽混入水解液后，在酸性條件下進(jìn)行離予交換層析時(shí)會(huì)生成二氧化碳，從而在柱中形成氣泡。RNA堿水解液調(diào)至pHl．5上柱，此時(shí)，核苷酸的磷酸基團(tuán)因進(jìn)行一級(jí)解離而帶負(fù)電荷，二級(jí)解離不能進(jìn)行；UMP無NH=基，GMP、CMP和AMP的一NH=基各有不同程度的解離而帶正電荷。各核苷酸所帶凈電荷如下：UMP為一0．75，GMP為0，CMP為+0．16，AM P為+0·19。顯然，UMP因不帶正電荷不與樹脂上陽離子發(fā)生交換而直接流出，GMP凈電荷為0，依靠嘌呤環(huán)與樹脂母體之間的輔助性吸附力吸附于樹脂上，CMP和AMP則因帶正電荷與樹脂上陽離子發(fā)生交換而被吸附，同時(shí)也有不同程度的輔助性吸附力存在。洗脫過程中，逐漸升高pIj。在pH2—5之問，由于一NH=解離pK值的不同而使各核苷酸所帶的凈電荷產(chǎn)生明顯差異，同時(shí)也由于核苷酸與樹脂之間非極性吸附力存在著差異，因此使各核苷被先后洗脫下來，從而達(dá)到分離的目的。由于各廠家出品的樹脂性能不完全相同，因此，應(yīng)根據(jù)實(shí)際條件選擇不同的洗脫液。本實(shí)驗(yàn)在樣品上柱后，先用pHl．5的HCI溶液洗脫，待UMP全部流出后，再換用pH3．5的HCI(o．0003N)溶液洗脫。根據(jù)備核苷酸所帶凈電荷的差異，洗睨次序應(yīng)為UMP--GMP--AMP--CMP，但由于聚苯乙烯樹脂母體對(duì)嘌呤堿的輔助性吸附力大于對(duì)嘧啶堿的吸附力，因而使AMP與CMP的洗脫位置互換，實(shí)際洗脫順序?yàn)閡MP—GMP--CMP--AMP若用陰離子交換樹脂分離，可將上柱樣品液調(diào)到pH8，使各核苷酸帶負(fù)電荷而被吸附上柱，洗脫時(shí)則逐步降低pH，使各核苷酸分別洗脫下來。DNA對(duì)堿穩(wěn)定，一般情況下不被堿水解，對(duì)酸不太穩(wěn)定，若用稀酸溫和水解得到的是脫嘌呤酸和嘌呤堿基，用濃酸水解則得到游離堿基。因此，實(shí)驗(yàn)室制備脫氧單核苷酸只能采用酶解法。用5L磷酸二酯酶或3’一磷酸二酯酶水解DNA可分別獲得5’-或3’-脫氧單核苷酸。本實(shí)驗(yàn)用桔青霉5L磷酸二酯酶(即Nuelease PI)水解魚精DNA，得到5L脫氧單核苷酸。該酶的最適pH為4．5—6．0，最適溫度為70℃～80℃，鋅離子有激活作用。以雙鏈DNA作酶反應(yīng)底物時(shí)，水解速度極慢，因此，在酶解前必須先將DNA熱變性。該酶制劑中往往混有磷酸單酯酶，它會(huì)將5L脫氧單核苷酸水解成無機(jī)磷酸和脫氧核苷，但此酶作用的最適溫度為45℃，因此通過控制酶解溫度就可在一定程度上抑制單酯酶對(duì)5’一脫氧單核苷酸的分解，從而得到較多量的51-脫氧核苷酸。10微升微量進(jìn)樣器1支，分析天平，751G型分光光度計(jì)；電熱恒溫水浴鍋}離心沉淀器，
2．  材料
(1)  魚精DNA(上海長陽制藥廠產(chǎn)品，純度約80％<紫
外法>法見附)
 3．  試劑
(1)0．5MpH5．6乙酸鹽緩沖液
(2)0．1MZnCl2
(3)5’一磷酸二酯酶酶液(2000單位／毫升)：稱取酶
(16萬單位／克)12毫克，溶于l毫升0．5MpH5．6乙酸鹽緩
沖液中，置4℃冰箱存放。
 (4)市售粗食鹽
(5)  冰
1．DNA溶液配制t在分析天平上稱取魚精DNA 10毫克，置1．5 X 10厘米小試管中，加入0．8毫升蒸餾水，用玻棒磨片刻后，室溫放置過夜使溶解。
2．DNA熱變性將裝有上述DNA溶液的小試管置lOO℃沸水浴中保溫10分鐘(先保溫1—2分鐘，塞上木塞后繼續(xù)保溫)，取出置千冰一丙酮或鹽冰浴(250毫升燒杯內(nèi)放冰塊，再撒粗鹽若干)中驟冷。
3．酶解 將變性DNA溶液置于70。C恒溫水浴中預(yù)熱2分鐘，加入0．1毫升0．5MpH5．6乙酸鹽緩沖液，10微升0·IMZnCI。溶液和0．1毫升5L磷酸二酯酶酶液(2000單位／毫升)。反應(yīng)系統(tǒng)中各物質(zhì)終濃度為：lOmg／mlDNA，0．05M乙酸鹽緩沖液，0．001MZn”，200單位／毫升酶�；旌暇鶆蚝笥�70。C恒溫水浴中保溫2．5小時(shí)。
4．  終止酶解將上述反應(yīng)液從70℃水浴中取出，立即置沸水浴中保溫10分鐘，終止酶反應(yīng)。