離心技術(shù)
離心是利用旋轉(zhuǎn)運(yùn)動(dòng)的離心力以及物質(zhì)的沉降系數(shù)或浮力密度的差異進(jìn)行分離、濃縮和提純的一種方法。顆粒的沉降速度取決于離心機(jī)的轉(zhuǎn)速及其自身與中心軸的距離。不同大小、形狀和密度的顆粒會(huì)以不同的速度沉降。
懸浮在液體中的固相顆粒的運(yùn)動(dòng)速度取決與：
1、重力。液體中的顆粒處在重力場(chǎng)內(nèi)時(shí)，如在一支平穩(wěn)的試管內(nèi)，將會(huì)受到地球的重力作用而運(yùn)動(dòng)。
2、固液相對(duì)密度的差別。相對(duì)密度小于液相的顆粒懸浮在上面，相對(duì)密度大于液相的顆粒則沉淀下來。
3、顆粒的大小與形狀。
4、沉降介質(zhì)的粘滯力。
一、離心力的計(jì)算
離心機(jī)的加速度通常以重力加速度的倍數(shù)來表示，稱為相對(duì)離心力RCF。RCD取決于轉(zhuǎn)子的轉(zhuǎn)速n和旋轉(zhuǎn)半徑r。一般情況下，低速離心時(shí)常以轉(zhuǎn)速r/min來表示，高速離心時(shí)則以g表示。計(jì)算顆粒的相對(duì)離心力時(shí)，應(yīng)注意離心管與旋轉(zhuǎn)軸心的距離r不同，即沉降顆粒在離心管中所處位置不同，則所受離心力也不同。因此在報(bào)告超離心條件時(shí)，通�？偸怯玫匦囊Φ谋稊�(shù)“×g”代替每分鐘轉(zhuǎn)數(shù)“r/min”，因?yàn)樗梢哉鎸?shí)地反映顆粒在離心管內(nèi)不同位置的離心力及其動(dòng)態(tài)變化。應(yīng)用中，習(xí)慣上所說的RCF值都是指旋轉(zhuǎn)的平均半徑r。
二、離心分離的方法
（一）、差速沉降（沉淀）法
將一混合懸浮液以一定的RCF離心一定的時(shí)間后，混合物將會(huì)被分為沉淀和上清液兩部分。（1）、離心前盛在離心管內(nèi)的是含有大、中、小三種顆粒的懸浮液；（2）、低速離心后，沉淀主要由最大的顆粒組成；（3）、進(jìn)一步用高速離心上清液，得到主要由中等大小顆粒組成的第二種沉淀；（4）、最后一步用離心把余下的小顆粒沉淀下來。
差速離心法主要用于分離細(xì)胞器和病毒，在各類分子生物學(xué)試驗(yàn)中還被應(yīng)用于基因DNA、質(zhì)粒DNA以及RNA等遺傳物質(zhì)的初級(jí)分離。其優(yōu)點(diǎn)是：操作簡(jiǎn)單，離心后用傾倒法即可將上清液與沉淀分開，并可使用容量較大的角式轉(zhuǎn)子。其缺點(diǎn)是：1、分離效果差，不能一次得到純顆粒；2、壁效應(yīng)嚴(yán)重，特別是當(dāng)顆粒很大或濃度很高時(shí)，在離心管一側(cè)會(huì)出現(xiàn)沉淀；3、顆粒被擠壓，離心力過大、離心時(shí)間過長(zhǎng)會(huì)使顆粒變形、聚集而失活。這些效應(yīng)在實(shí)驗(yàn)中往往會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞器的破裂、基因組DNA的斷裂等等不利影響。所以在應(yīng)用差速沉降離心法分離時(shí)必須嚴(yán)格控制離心的速度與時(shí)間，以期在最大限度上防止負(fù)效應(yīng)的產(chǎn)生。
進(jìn)行差速離心首先要選擇好顆粒沉降所需的離心力和離心時(shí)間。當(dāng)以一定的離心力在一定的離心時(shí)間內(nèi)進(jìn)行離心時(shí)，在離心管底部就會(huì)得到最大和最重顆粒的沉淀，分出的上清液在加大轉(zhuǎn)速下進(jìn)行離心，又得到第二部分較大較重顆粒的沉淀及含較小和較輕顆粒的上清液，如此多次離心處理，既能把液體中的不同顆粒較好地分離開。此法所得的沉淀是不均一的，仍雜有其他成分，需經(jīng)過2～3次的在懸浮和再離心，才能得到較純的顆粒。
（二）、密度梯度離心法（簡(jiǎn)稱區(qū)帶離心法）
區(qū)帶離心法是樣品在一定惰性梯度介質(zhì)中進(jìn)行離心沉淀或沉降平衡，在一定離心力下把顆粒分配到梯度中某些特定位置上，形成不同區(qū)帶的分離方法。其原理是利用離心力使樣品混合物中具有不同密度的組分沿著介質(zhì)的梯度移動(dòng)，最終停留在與其密度相等的介質(zhì)區(qū)域。該法的優(yōu)點(diǎn)是：1、分離效果好，可一次活的較純顆粒；2、適應(yīng)范圍廣，既能分離具有沉淀系數(shù)差的顆粒，又能分離有一定浮力密度的顆粒；3、顆粒不會(huì)積壓變形，能保持顆�；钚�，并防止已形成的區(qū)帶由于對(duì)流而引起混合。其缺點(diǎn)是：1、離心時(shí)間較長(zhǎng)；2、需要制備梯度；3、操作嚴(yán)格，不宜掌握，且在離心完成后，樣品往往需要用穿刺法吸出，操作較為復(fù)雜。在生物化學(xué)試驗(yàn)中，密度梯度離心法主要用于分離那些由于密度或沉降系數(shù)相似從而用差速離心法難以分離的物質(zhì)。
下列技術(shù)使用了密度梯度，即離心管中的溶液從管頂?shù)焦艿酌芏戎饾u增加
1、差速區(qū)帶離心法
將樣品置于平緩的預(yù)先制好密度梯度介質(zhì)上進(jìn)行離心，較大的顆粒將比較小的顆粒更快地沉降通過梯度介質(zhì)，形成幾個(gè)明顯的區(qū)帶（條帶）。這種方法有時(shí)間限制，在任一區(qū)帶到達(dá)管底之前必須停止離心。差速區(qū)帶離心法僅用于分離有一定沉降系數(shù)數(shù)差的顆粒，與密度無關(guān)。大小相同、密度不同的顆粒（如溶酶體、線粒體和過氧化物媒體）不能用本法分離。離開原樣品層，按不同沉降速率沿管底沉降。離心一定時(shí)間后，沉降的顆粒逐漸分開，最后形成一系列界面清楚的不連續(xù)區(qū)帶。沉降系數(shù)越大，往下沉降的速度越快，所呈現(xiàn)的區(qū)帶也越低。沉降系數(shù)較小的顆粒，則在較上部分依次出現(xiàn)。從顆粒的沉降情況看來，離心必須在沉降最快的顆粒（大顆粒）到達(dá)管底前或剛到達(dá)管底時(shí)結(jié)束，使顆粒處于不完全的沉降狀態(tài)，而出現(xiàn)在某一些特定的區(qū)帶內(nèi)。
在離心過程中，區(qū)帶的位置和形狀（或帶寬）隨時(shí)而改變。因此，區(qū)帶的寬度不僅取決于樣品組分的數(shù)量、梯度的斜率、顆粒的擴(kuò)散作用和均一性，也與離心時(shí)間有關(guān)。時(shí)間越長(zhǎng)，區(qū)帶越寬。適當(dāng)增加離心力可縮短離心時(shí)間，并可減少擴(kuò)散導(dǎo)致的區(qū)帶加寬現(xiàn)象，增加區(qū)帶界面的穩(wěn)定性。
2、等密度離心法
當(dāng)不同顆粒存在浮力密度差時(shí)，在離心力場(chǎng)下，顆粒或向下沉降，或向上浮起，一直沿梯度移動(dòng)到與它們密度恰好相等的位置上（即等密度點(diǎn)）形成區(qū)帶，稱為等密度離心法。等密度離心的有效分離取決于顆粒的浮力密度差，密度差越大，分離效果越好，與顆粒的大小和形狀無關(guān)。但后兩者決定著達(dá)到平衡的速率、時(shí)間和區(qū)帶的寬度。顆粒的浮力密度不是恒定不變的，還與其原來密度、水化程度及梯度溶質(zhì)的同透性或溶質(zhì)與顆粒的結(jié)合等因素有關(guān)。例如，某些顆粒容易發(fā)生水化使密度降低。
這種技術(shù)根據(jù)浮力密度的不同分離物質(zhì)。其分辨率受顆粒性質(zhì)（密度、均一性和含量）、梯度性質(zhì)（形狀、黏度和斜率)、轉(zhuǎn)子類型、離心速率和時(shí)間的影響。顆粒區(qū)帶寬度與梯度斜率、離心力、顆粒相對(duì)分子質(zhì)量成正比。幾種物質(zhì)可通過離心法形成密度梯度（如蔗糖、葡萄糖、菲可和尼克登）。將樣品與適當(dāng)?shù)慕橘|(zhì)混合后離心——各種顆粒在與其等密度的介質(zhì)帶處形成沉淀區(qū)帶。這種方法要求介質(zhì)梯度應(yīng)有一定的陡度，要有足夠的離心時(shí)間形成梯度顆粒的再分配，進(jìn)一步離心對(duì)其不會(huì)有影響。
可以使用一根細(xì)的巴氏滴管或帶有細(xì)長(zhǎng)針頭的注射器來收集某個(gè)密度梯度內(nèi)的條帶，另一種方法可將試管刺穿，將內(nèi)容物分段逐滴收集到幾個(gè)管中。
（三）、分析性超速離心
與制備性超速離心不同的是，分析性超速離心主要是為了研究生物大分子的沉降特性和結(jié)構(gòu)，而不是專門收集某一特定組分。因此它使用了特殊的轉(zhuǎn)子和檢測(cè)手段，以便連續(xù)監(jiān)視物質(zhì)在一個(gè)離心場(chǎng)中的沉降過程。
1、分析性超速離心的工作原理
分析性超速離心機(jī)主要由一個(gè)橢圓形的轉(zhuǎn)子、一套真空系統(tǒng)和一套光學(xué)系統(tǒng)組成。該轉(zhuǎn)子通過一個(gè)柔性的軸鏈接成一個(gè)高速的驅(qū)動(dòng)裝置，此軸可使轉(zhuǎn)子在旋轉(zhuǎn)時(shí)形成自己的軸。轉(zhuǎn)子在一個(gè)冷凍的真空腔中旋轉(zhuǎn)，其容納兩個(gè)小室：分析室和配衡室。配衡室是一個(gè)經(jīng)過精密加工的金屬塊，作為分析室的平衡用。分析室的容量一般為1mL，呈扇形排列在轉(zhuǎn)子中，其工作原理與一個(gè)普遍水平轉(zhuǎn)子相同。分析室有上下兩個(gè)平臺(tái)的石英窗，離心機(jī)中裝有的光學(xué)系統(tǒng)可保證在整個(gè)離心期間都能觀察小室中正在沉降的物質(zhì)，可以通過對(duì)紫外光的吸收（如對(duì)蛋白質(zhì)和DNA）或折射率的不同對(duì)沉降物進(jìn)行監(jiān)視。后一方法的原理是：當(dāng)光線通過一個(gè)具有不同密度區(qū)的透明液，在這些區(qū)帶的界面上產(chǎn)生光的折射。在分析室中物質(zhì)沉降的重粒子和輕粒子之間形成的界面就像一個(gè)折射的透鏡，結(jié)果在檢測(cè)系統(tǒng)的照相底板上產(chǎn)出一“峰”。由于沉降不斷進(jìn)行，界面向前推進(jìn)，故“峰”也在移動(dòng)，從峰移動(dòng)的速度可以得到物質(zhì)沉降速度的指標(biāo)。
2、分析性超速離心的應(yīng)用
測(cè)定生物大分子的相對(duì)分子質(zhì)量。測(cè)定相對(duì)分子質(zhì)量主要有三種方法：沉降速度、沉降平衡和接近沉降平衡。其中應(yīng)用最廣的是沉降速度。超速離心在高速中進(jìn)行，這個(gè)速度使得任意分布的粒子通過溶劑從旋轉(zhuǎn)的中心輻射地向外移動(dòng)，在清除了粒子的那部分溶劑和尚含有沉降物的那部分溶劑之間形成一個(gè)明顯的界面，該界面隨時(shí)間的移動(dòng)而移動(dòng)，這就是粒子沉降速度的一個(gè)指標(biāo)，然后用照相記錄，即可求出粒子的沉降系數(shù)。
生物大分子的純度估計(jì)。靜分析性超速離心已廣泛地應(yīng)用于研究DNA制劑、病毒和蛋白質(zhì)的純度。用沉降速度的技術(shù)來分析沉降界面是測(cè)定制劑均質(zhì)性的最常用方法之一，出現(xiàn)單一清晰的界面一般認(rèn)為是均值的，如果雜質(zhì)則在主峰的一側(cè)或兩側(cè)出現(xiàn)小峰。
分析生物大分子中的構(gòu)象變化。分析性超速離心已成功地用于檢測(cè)大分子構(gòu)象的變化。例如，DNA可能以單股或雙股出現(xiàn)，其中每一股在本質(zhì)上可能是線性的，也可能是環(huán)狀的，如果遇到某種因素（溫度或有機(jī)溶劑）DNA分子可能發(fā)生一些構(gòu)象上的變化，這些變化也許可逆、也許不可逆，這些構(gòu)象上的變化可以通過檢查樣品在沉降速度上的差異來證實(shí)。
技術(shù)支持: