動物細(xì)胞的分離及凍存、復(fù)蘇為了進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，首先要從生物體去的細(xì)胞，目前獲取細(xì)胞的方法有兩種，即離心分離法和消化分離法。
1、離心分離法
離心分離法主要用從含有細(xì)胞的體液如血液、羊水、腹腔水中分離細(xì)胞。此時一般用800-1000r/min的速度離心5-10min即可。離心速度過高或時間過長，易擠壓細(xì)胞使之受傷或死亡。
2、消化分離法
消化分離法是先從生物體取來的組織塊，將其剪碎，并用消化液將其笑話，使組織松散呈細(xì)胞懸液，然后用緩沖液洗滌、離心、去除殘留的消化液而獲得所需的細(xì)胞。
常用的笑話液有胰蛋白酶、乙二胺四乙酸（EDTA）、或胰酶-檸檬酸鹽、胰酶-EDTA聯(lián)合使用。目前最常用的集中消化液配制方法如下： 1%胰蛋白酶溶液的配制
稱取胰蛋白酶10g，用少量Hanks液先將胰蛋白酶調(diào)成糊狀，補足Hanks液至1000ml，振搖混勻，置于4℃冰箱內(nèi)過夜，過濾除菌，分裝小瓶，低溫冰箱冰凍保存，同時取樣做無菌實驗。使用時用Hanks液稀釋成0.25%或0.125%，并用NaHCO3調(diào)至PH=7.0或偏堿性。
0.02%EDTA溶液的配制
稱取EDTA0.2g，用1000ml Hanks溶液溶解。8磅 15-20min高壓滅菌，分裝小瓶，4涉世度冰箱保存?zhèn)溆茫瑫r留樣做無菌實驗。
胰酶-檸檬酸鹽配制
胰酶（1:250）2.50g，檸檬酸三鈉2.96g，NaCL6.15g,酚紅（1%）1.5ml，無離子水1L。 用NaOH調(diào)至PH=7.5，過濾除菌，分裝小瓶，并作無菌實驗。
胰酶-EDTA溶液的配制
取1份0.025%胰酶或胰酶-檸檬酸鹽溶液加4份0.02%EDTA溶液構(gòu)成，可先用現(xiàn)配，也可事先配好，分裝低溫保存?zhèn)溆谩?/span>
細(xì)胞的凍存
細(xì)胞和整體生物一樣，當(dāng)溫度降低時，他的代謝也降低，從而大大的延長了他的存活期。因此目前為了保存細(xì)胞，都采用液氮低溫凍存的方法，用該方法細(xì)胞可保存幾年甚至幾十年。在凍存過程中，滲透壓的改變會影響到脂蛋白，使細(xì)胞膜破裂，為了防止電解質(zhì)過分濃縮，可采用某些保護(hù)劑，如甘油和二甲基亞砜。他們的相對分子量低，易于溶解，容易滲入細(xì)胞，在冷凍時，冷凍速度很重要，不能太快也不能太慢。太慢會產(chǎn)生冰晶損傷細(xì)胞，太快不足以是水分排出。一般要求以1℃/min的速度健將為宜。在無定速降溫設(shè)備時，可按如下三種方法處理1 將安瓿放入壁厚為1.5cm的聚乙烯盒內(nèi)，然后放入-70℃冰箱內(nèi)2h，在轉(zhuǎn)入液氮。2將安瓿置于4℃冰箱4-5小時或過夜，在移至-70℃冰箱內(nèi)2小時，在選育液氮莖口1小時最后浸入液氮。3放在凍存簡易裝置內(nèi)，置于液氮罐莖口，離液氮面5-10cm，2-3小時候浸入液氮。
細(xì)胞凍存中還有幾點注意事項
1、凍存的細(xì)胞需處在良好的營養(yǎng)狀態(tài)，故在凍存前一天要換液培養(yǎng)。 2、細(xì)胞密度以1*10六次方或2*10六次方為好
3、配制東村用培養(yǎng)基要與實際使用一致，另加入保護(hù)劑二甲基亞砜或甘油10%，二甲基亞砜要過濾除菌，不要用高壓蒸汽滅菌。
4、分裝安瓿若用玻璃的安瓿，封口后要檢查其密封性，可將其浸入甲基藍(lán)乙醇溶液，若有裂紋，可見藍(lán)色進(jìn)入安瓿。
5、標(biāo)簽上要寫上細(xì)胞名稱，編號和凍存日期，最好外面再貼一層透明膠紙。
細(xì)胞的復(fù)蘇
復(fù)蘇時，總的要求是要快熔，在實際操作中應(yīng)注意如下幾點
1、為了防止因玻璃安瓿封口不好，在融化時滲入的液氮引起安瓿爆炸，在操作中藥注意防護(hù)，戴面罩和手套。
2、從液氮罐中取出的安瓿，應(yīng)立即丟入37-40℃的溫水搪瓷杯中（玻璃燒杯，容易爆炸），并膠東加速融化，
3、用乙醇消毒安瓿外表。
4、由于二甲基亞砜對細(xì)胞有一定的毒性，故應(yīng)盡早去除，或?qū)⒓?xì)胞離心，換上新鮮培養(yǎng)基或先將細(xì)胞懸液直接種入培養(yǎng)瓶中（加入10ml培養(yǎng)基），4-6小時后，代細(xì)胞貼壁后立即換液。
5、隔天觀察細(xì)胞生長情況，再換液一次。
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